【血浆蛋白质组学】Cancers|发现预测结直肠癌新辅助治疗敏感性蛋白标志物

2021-09-28

广科安德的首席PI Samir Hanash 教授与质谱专家王洪博士于2021年7月20日在《Cancers》杂志（IF=6.63）上发表题为”Identification of Blood-Based Biomarkers for the Prediction of the Response to Neoadjuvant Chemoradiation in Rectal Cancer” 的文章，发现预测直肠癌新辅助治疗敏感性蛋白标志物。

中文标题：发现预测直肠癌新辅助治疗敏感性蛋白标志物

研究对象：血浆

发表期刊：Cancers

影响因子：6.63

发表时间：2021年7月

合作单位：MD 安德森癌症中心

运用关键技术：定量血浆蛋白质组学

研究背景

结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是世界第三高发恶性肿瘤，在我国的发病率呈逐年上升趋势，平均发病年龄48.3岁。世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer, IARC）数据显示：2020年我国新发结直肠癌56万例，结直肠癌死亡29万例。约25%的患者在初诊时已出现肝肺转移，严重影响患者的预后管理。2021年中国临床肿瘤学会（CSCO）指南对于中低危直肠癌患者建议先使用新辅助放化疗（neoadjuvant chemoradiation therapy，nCRT）以提高患者病理完全缓解率（pathologic complete response，pCR），再行全直肠系膜切除手术治疗（total mesorectal excision,TME）。然而，直肠癌对nCRT的敏感性是高度可变的，仅有约20%的患者表现出pCR，多数患者的nCRT治疗仅得到部分或无肿瘤衰退。此外，TME伴有围手术期死亡、吻合口瘘、造口相关并发症、长期泌尿功能和性功能障碍等风险。研究发现nCRT后行TME治疗与nCRT后行等待观察策略在五年生存率方面无显著性差异。对nCRT后获得临床完全缓解（clinical complete response，cCR）的患者可以采取等待观察策略（watch-and-wait strategy）而避免TME导致的副作用。但是cCR与pCR之间的一致性很差，极大限制了等待观察策略的实际应用。目前，nCRT已用于临床II/III期或直肠结节阳性且无转移扩散的局部进展期直肠癌（locally advanced rectal cancer，LARC）的标准化治疗。寻找发现预测pCR生物标志物对鉴别哪些患者在nCRT后采取等待观察策略、避免不必要的TME治疗和建立精准个性化治疗方案至关重要。

nCRT的响应程度与肿瘤大小、细胞分化、临床分期、结节大小和肿瘤衰退率等因素相关。有关组织和血液分子标志物（DNA甲基化、蛋白质、miRNA、cfDNA和CEA）预测nCRT敏感性的研究已有报道，然而上述标志物由于缺乏足够的灵敏度和特异性而远未达到临床应用的要求。近期我公司王洪博士参与的由MD安德森癌症中心、梅奥医学中心、名古屋大学医学院和宾夕法尼亚大学医学中心组成的多中心直肠癌nCRT敏感性研究成果发表于《Cancers》期刊。该工作使用结直肠癌基因工程小鼠模型（具有强力霉素诱导致癌基因Kras等位基因和Apc与Trp53无效等位基因，iKAP），通过直肠灌肠4-羟基他莫昔芬/强力霉素激活Cre DNA重组酶而诱发小鼠直肠癌（经结肠镜和MRI确定）。然后对小鼠实施连续5天的CRT（腹腔注射5-氟尿嘧啶/同步辐射，5 Gy/次）。分别采集CRT前5天和CRT第3天的血样，采用TMT标记技术进行高通量深度定量血浆蛋白质组学分析，鉴定CRT敏感性蛋白标志物。通过对发现的标志物在LARC患者验证队列的免疫分析，确定预测LARC患者nCRT敏感性标志物。

技术路线

基因工程iKAP小鼠的CRT敏感性实验和定量血浆蛋白质组学分析技术路线分别如图-1和图-2所示。对CRT后肿瘤衰退小鼠（pCR）、无肿瘤衰退小鼠（non-pCR）和对照组小鼠（Control）进行差异蛋白质组学分析。

图-1. iKAP小鼠模型研究CRT敏感性

图-2. CRT敏感性蛋白标记物的发现研究

主要研究结果1：

放化疗敏感性蛋白标记物的发现

从血浆蛋白质组学分析中鉴定567种差异表达蛋白，对其中的上调蛋白（ratio：pCR/Control > 2，non-pCR/Control > 2）进行信号通路分析和功能富集分析，结果列于表-1。

其中在pCR组和non-pCR组中均出现了与代谢相关的4种信号通路，包括糖酵解/葡糖异生、氨基酸生物合成、糖尿病合并症AGE-RAGE通路和碳代谢。在non-pCR组中出现了涉及免疫系统与传染病、细胞内转运与分解代谢、局灶性黏附和内分泌系统的9种信号通路（图-3）。

结合检测灵敏度与特异性，作者使用如下评判标准确定候选蛋白标志物：

① 具有定量信息的肽段数目>10；

② non-pCR/Control > 3；

③ non-pCR/pCR > 3。

一共有9种蛋白通过了上述评判标准（结果列于表-2），这些蛋白出现在non-pCR组的局灶性黏附和溶酶体等信号通路中，细胞局灶性黏附功能的失调会导致放化疗的耐受性，表明这些蛋白与直肠癌的CRT敏感性有关。其中，血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR3）、胰岛素样生长因子结合蛋白4（insulin like growth factor binding protein 4，IGFBP4）和组织蛋白酶B（cathepsin B，CTSB）等三种蛋白入选nCRT敏感性验证评估实验。

此外，作者前期使用组织蛋白质组学研究发现4种与LARC新辅助放化疗敏感性相关的蛋白：表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR), 细胞增殖蛋白（Ki-67）, 前列腺素环氧化酶（Prostaglandin G/H synthase 2，COX2）和上皮钙黏着蛋白（E-cadherin）。对这4种组织蛋白标志物（EGFR, Ki-67, COX2, E-cadherin）和本工作发现的3种血浆蛋白标志物（VEGFR3, IGFBP4, CTSB）及CEA（carcinoembryonic antigen）在独立的验证队列进行免疫分析测定。

图-3. 仅在non-pCR中出现的信号通路

主要研究结果2：

放化疗敏感性蛋白标质物的验证评估分析

验证队列来自34例LARC患者，对接受nCRT前的血浆中EGFR、Ki67、COX2、E-cadherin、VEGFR3、IGFBP4、CTSB和CEA等8种蛋白的水平进行了免疫分析测定（图-4）。结果发现：

① non-pCR患者中VEGFR3、EGFR和COX2的血浆水平显著高于pCR患者；

② CEA、Ki67、E-cadherin、IGFBP4和CTSB的血浆水平在non-pCR患者和pCR患者之间无显著性差异；

③ 4种组织蛋白中的EGFR和COX2的血浆水平可以预测nCRT的敏感性，其在non-pCR LARC患者血浆水平显著高于pCR LARC患者的血浆水平（EGFR:p = 0.0128, COX2: p = 0.0397）；

④ 逻辑回归分析显示VEGFR3、COX2和EGFR 的3种蛋白组合比单个蛋白能更好区分non-pCR患者和pCR患者（图-5），AUC为0.869（特异性95%、灵敏度43%）。

图-4. 候选蛋白标志物的免疫分析

图-5. 单个蛋白标志物与3种蛋白组合的特异性与灵敏度评估分析

主要研究结果3：

VEGFR3、EGFR和COX2血浆水平

在直肠癌患者术前和术后的变化

对另外18例接受手术切除治疗的直肠癌患者（术后无病生存期5年以上）的术前和术后的VEGFR3、EGFR和COX2血浆水平分析发现，VEGFR3和EGFR的血浆水平在术后显著下降（VEGFR3: p = 0.0119, EGFR: p = 0.0058），而COX2的血浆水平在术前和术后没有显著性变化（图-6）。

VEGFR3主要在淋巴管内皮细胞表达，VEGFR3和其配体VEGF-C在包括结直肠癌在内的多种肿瘤细胞中有较高的表达水平。VEGF-C/VEGFR3信号通路的激活会破坏淋巴内皮屏障和诱导与肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）的免疫抑制而促进结直肠癌肿瘤细胞生长和侵袭。多种针对VEGF-C/VEGFR3信号通路的靶向治疗，包括VEFGR3小分子抑制剂、VEGF-C单克隆抗体及阻断VEGFR3信号通路的多肽和中和性抗体已有报道。血液循环VEGFR3水平不仅可以预测直肠癌患者nCRT的敏感性，还可作为VEGF-C/VEGFR3靶向治疗的预后标志物。

结直肠癌患者在接受EGFR抗体靶向治疗后，EGFR的肿瘤组织表达水平显著下降。这表明血液循环EGFR水平既具有预测直肠癌患者nCRT敏感性的作用，还可以辅助判断是否持续进行EGFR抗体靶向治疗。

作者在前期研究发现COX2在LARC肿瘤组织中的过表达与nCRT的不敏感性有关。COX2由各种炎症介质诱发，临床试验表明LARC患者接受nCRT联合COX2塞来昔布抑制剂可以提高疗效和降低毒性。因此血液循环COX2水平可作为nCRT和COX2抑制剂联合治疗敏感性和预后标志物。

结论

1. 血液循环VEGFR3水平可作为预测局部进展期直肠癌（LARC）患者接受新辅助放化疗（nCRT）敏感性的全新标志物。

2. 首次发现预测nCRT敏感性的组织标志物EGFR和COX2的血液循环水平与LARC患者的无病理完全缓解率（non pathologic complete response，non-pCR）相关，可作为nCRT敏感性标志物。

3. 相对于单一标志物检测，血液中VEGFR3、EGFR和COX2联合检测可以更好预测LARC患者的nCRT敏感性。

4. 蛋白质组学发现的血液蛋白质标志物为进一步研究LARC患者安全采纳等待观察策略（watch-and-wait strategy）提供了参考依据。

5. 血液VEGFR3、EGFR和COX2水平不仅可以预测nCRT敏感性，还可以作为靶向治疗敏感性和预后标志物。

参考文献

1. Delphine Dayde, Ichidai Tanaka, Rekha Jain, Mei Chee Tai, Ayumu Taguchi. “Predictive and Prognostic Molecular Biomarkers for Response to Neoadjuvant Chemoradiation in Rectal Cancer”. Int. J. Mol. Sci. 18, 573 (2017).

2. Delphine Dayde, Jillian Gunther, Yutaka Hirayama, David C. Weksberg, Adam Boutin, Gargy Parhy, Clemente Aguilar-Bonavides, Hong Wang, Hiroyuki Katayama, Yuichi Abe, Kim-Anh Do, Kazuo Hara, Takashi Kinoshita, Koji Komori, Yasuhiro Shimizu, Masahiro Tajika, Yasumasa Niwa, Y. Alan Wang, Ronald DePinho, Samir Hanash, Sunil Krishnan, Ayumu Taguchi. “Identification of Blood-Based Biomarkers for the Prediction of the Response to Neoadjuvant Chemoradiation in Rectal Cancer”. Cancers (Basel). 13(14): 3642 (2021).