宏病毒组(病毒宏基因组)
背景介绍

微生物世界是分子多样性最大的天然资源库,从个体体表到肠道,从高原空气到深海海底淤泥,从冰川冻湖到火山岩浆都无处不在,并扮演着不可或缺的角色。基于菌株水平的传统分离培养技术为人们认识微生物多样性提供了可能,但是据估计自然界中超过99%的微生物不能通过传统的分离培养技术获得其纯培养,从而导致环境微生物中的多样性基因资源难以被发现。如何开拓利用环境微生物新资源是微生物研究的重要课题,为此研究者们开发了多种以特定环境微生物为研究对象的高通量测序方法[1]

宏基因组学(Metagenomics)是研究微生物组整体基因组的学科,旨在通过高通量测序技术对微生物组中的DNA进行测序,并利用生物信息学方法分析这些数据。宏基因组学的发展使得研究人员能够更全面地了解微生物组的多样性、功能潜力和相互作用,从而深入探究微生物与环境、宿主健康等方面的关系。在医学领域,宏基因组学被广泛应用于研究微生物与人类疾病之间的关系,探索疾病的发病机制,发现新的治疗靶点,以及实现个性化医疗等方面[2,3]

近年来,随着测序技术和信息技术的快速发展,利用新一代测序技术(NGS,Next Generation Sequencing)研究Metagenomics,能快速准确的得到大量微生物基因数据和丰富的微生物研究信息,从而成为研究微生物多样性和群落特征的重要手段,如致力于研究微生物与人类疾病健康关系的人体微生物组计划(HMP, Human Microbiome Project),研究全球微生物组成和分布的全球微生物组计划(EMP, Earth Microbiome Project)都主要利用高通量测序技术进行研究[4,5]

建库测序流程

从环境(如土壤、海洋、淡水、肠道等)中采集实验样本,将原始采样样本或已提取的DNA样本低温运输(0℃ 以下)送往我公司。我公司将对接收到的样品进行样品检测。

检测合格的 DNA 样品,进行文库构建以及文库检测,检测合格的文库将采用Illumina PE150进行测序,测序得到的下机数据(Raw Data)将用于后期信息分析。为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性,广科安德对样品检测、建库、测序每一个生产步骤都严格把控,从根本上确保高质量数据的产出,具体的实验流程图如下:

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DNA样品检测

文库构建和测序需要获得足够数量的高质量核酸,广科安德对DNA样品的检测主要包括2种方法:

1. 琼脂糖凝胶电泳(AGE)分析DNA的纯度和完整性;

2. Qubit对DNA浓度进行精确定量。

文库构建及库检

检测合格的DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度约为400bp的片段,经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。

文库构建完成后,先使用Qubit进行初步定量,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量,以保证文库质量。

上机测序

库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina PE150测序。