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宏基因组测序

服务介绍生信分析经典案例

文章名称：炎症性肠病肠道菌群结构与代谢活动的研究

发表机构：麻省理工学院,哈佛大学

杂志：Nature Microbiology

发表时间：2019.5.4

测序技术：宏基因组；LC-MS代谢组

影响因子：14.3 一区

关键词：炎症性肠病，肠道菌群，代谢物

样本类型及数目：炎症性肠病（IBD），包括克罗恩氏病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）总共220例粪便样本

研究背景

炎症性肠道疾病(inflammatory bowel disease, IBD) 是一种肠道慢性疾病，由肠道微生物和肠道免疫系统交互作用的变更所引起。溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）是IBD中常见的亚型代表, 发病的位置分别为大肠（结肠粘膜层）和整个肠道中。临床表现为腹泻、腹痛、消瘦和贫血，常常伴随并发症，甚至出现肠穿孔、血便以及癌变。IBD在世界范围内的患者多达500多万人且发病率和患病率在所有人群中均呈上升趋势，已成为威胁人类健康的全球性疾病。之前的研究表明，IBD患者的肠道菌群结构发生了显著变化。同时，菌群结构能够通过代谢物的方式改变结肠生态环境，而这些代谢物能够影响微生物群与宿主之间的相互关系，对机体信号通路、免疫系统调节或者抗菌活性具有重要作用。然而，特定的微生物和它们所调控的小分子，与炎症的引发、维持、缓解或者预测如IBD之间的相互作用关系并不清楚，同时还没有明确的方法可以有效的区分CD与UC。

材料方法

两个队列

1 发现队列
PRISM 155例

2 验证队列
LifeLines DEEP以及NLIBD 65例

两种技术

1 宏基因组
主要研究内容是物种分类，基因以及通路信息；
宏基因组分析流程：

2 代谢组
采用 LC-MS、GC-MS、NMR技术，无偏向性的检测细胞、组织、器官或者生物体内受到刺激或扰动前后所有小分子代谢物(主要是相对分子量1000 Da以内的内源性小分子化合物)的动态变化。通过生信分析筛选差异代谢物，对差异代谢物进行通路分析，揭示其变化的生理机制。运用四种LC-MS(液相色谱质谱联用)法：
（1）极性代谢物(正离子) :例如有机酸;polar metabolites (e.g. organic acids)

（2）极性代谢物(负离子) :例如有机酸;polar metabolites (e.g. organic acids)

（3）极性和非极性脂质:例如甘油三酸酯 ;lipids (e.g. triglycerides)

（4）中等极性代谢物:游离脂肪酸和胆汁酸; free fatty acids and bile acids

研究结果

样本数据多样性分析

基于两个组学数据，作者通过PCoA分析比较不同的发现集分组间代谢物和微生物之间的差异，而d-e展示的为各样本代谢图谱和宏基因组图谱与粪便的钙卫蛋白 (肠炎指标) 水平之间关系。

差异代谢物分析

通过t-test，作者发现在IBD病人中，鞘脂类和胆汁酸类物质富集，同时三酰甘油和四吡咯的含量减少。IBD病人中富集的胆汁酸大多为初级胆汁酸，如胆酸盐和鹅去氧胆酸盐，说明IBD干扰了肠道菌群将初级胆汁酸代谢为次级胆汁酸；神经酰胺和鞘磷脂在IBD病人中富集，其会促进宿主的炎症状态；三酰甘油、长链脂肪酸和胆固醇在IBD个体中含量下降，说明IBD会干扰宿主的脂肪酸代谢。

微生物与代谢物相关性分析

在上面的分析中我们已将关注的代谢物缩小范围，那么怎么与微生物联系起来？这一步可以通过斯皮尔曼相关性计算方式相应关系。IBD中微生物和小分子物质的协变，确定的对照宏基因组种类和代谢物。当多重代谢物特征与相同标准物特征相匹配，选择均值绝对相关性最高的特征进行绘图。进一步挑出如R. gnavus与代谢物以右图展示。

微生物的功能与代谢物的关系

到这里本研究已经有了初步的结果，找到了一些潜在的代谢物与微生物。还有一块内容没有涉及到，就是宏基因组的功能分析。如下图展示，a-c在IBD组显著富集的酶，d-e在正常组显著富集的酶。在每一种情况下，酶都是由队列中的混合物种贡献的，而不是由单一物种主导的。主要物种的贡献在相对丰度的比例中。样本根据一个功能的主要贡献者进行排序，然后根据表型进行分组。我们获得了一批可能参与该过程的关键酶，并通过f-g总酶丰度和IBD相关代谢物之间的相关性进一步描述微生物的功能与代谢物之间的联系。

IBD诊断Biomarkers鉴定

本研究在设计实验的时候，已经考虑到验证集。因此基于筛选得到的关键微生物和代谢物，可以对随机森林模型和ROC分析建立的IBD诊断模型并进行校验。结果表明：使用微生物和代谢物共同进行IBD的诊断要比单一的诊断模型具有更高的准确性。从肠道微生物组和多重组学特征中预测IBD状态与亚型。RF分类分型用于代谢物，微生物种类以及它们的组合中以确定IBD患者和IBD亚型。

研究结论

与非炎症性肠病对照组相比，炎症性肠病患者的代谢物和代谢物种类经常减少，暗示炎症性肠病患者代谢多样性的丧失，类似于炎症性肠病患者微生物组中观察到的分类多样性的丧失。

代谢组学和宏基因组学上的特征变化与粪便中的钙网蛋白变化水平显著相关。

检测到的8000种特征代谢物中，鞘脂类、胆酸等在IBD中富集，三酰基甘油、四吡咯等则在健康对照中富集；超过50%显著差异代谢物难以鉴定，部分代谢物可通过相关性假定推测为某种物质。

宏基因组分析发现，IBD与非IBD人群肠道菌群种类及功能存在差异，反映出IBD肠道中对氧化应激的适应情况。差异菌群与差异代谢物间，共鉴定出122种明确的关联，表明在IBD中可能存在某些机制性关系进而导致了对肠道的扰乱。

根据代谢组学与宏基因组学数据利用随机森林预测模型可对IBD与非IBD进行区分，结果具有高度精确性。

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